Скачать PDF

Asmita Patel, Josh Robinson | Beckman Coulter, Inc.

Аннотация

В последнее десятилетие использование наночастиц золота становится все более популярным в области биомедицинских наук, особенно при визуализации опухолей¹, фототепловой терапии^2,3 и металл-усиленной флуоресценции. Используемые для таких задач наночастицы должны быть высококачественными, с монодисперсными размерами и соотношениями сторон.

В настоящих указаниях по применению приведена удобная методика выделения наночастиц золота из полидисперсного образца в градиенте плотности на центрифуге Avanti JXN.

Введение

Использование золотых стержневидных наночастиц (AuNR) является весьма перспективным направлением биомедицинской визуализации. AuNR характеризуются отчетливо выраженными пикаии поглощения в видимой и ближней инфракрасной области спектра благодаря плазмонному эффекту. Соотношение сторон AuNR напрямую определяет длину волны пика.

Для применения в области биомедицинской визуализации важно иметь оптически и физически чистые образцы золотых стержневидных наночастиц. Однако процесс синтеза AuNR обычно сопровождается появлением некоторых посторонних примесей в виде золотых наносфер (которые не вытягиваются) и неоптимальных AuNR с немного отличающимися соотношениями сторон.

Поскольку AuNR и золотые наносферы (AuNS) имеют один и тот же состав элементов, одинаковое покрытие поверхности в результате синтеза (в большинстве случаев - поверхностно-активное вещество цетилтриметиламмоний бромид-ЦТАБ (CTAB)) и сходные размеры, их разделение представляет собой большую проблему.

Центрифугирование в градиенте плотности (DGC) прекрасно подходит для разделения наночастиц с одинаковыми размерами, но с различной плотностью из-за незначительных сдвигов в соотношении площади поверхности/объема.

В рамках данного исследования мы работали с двумя образцами чистых AuNR: один – с соотношением сторон 41 (10 нм x 41 нм) и плазмоном 800 нм; другой – с соотношением сторон 2,4 (25 нм х 60 нм) и плазмоном 650 нм. Образцы сначала смешивали, а затем разделяли методом одноэтапного DGC на высокоскоростной центрифуге Avanti JXN-30 с бакетным ротором JS-24.15.

По результатам оптической спектроскопии было установлено, что разделенные образцы AuNR оказались такими же чистыми, как и исходные образцы до смешивания.

Материалы

Протокол

Центрифугирование золотых наночастиц в градиенте плотности. Стержневые наночастицы золота (AuNR) диаметром 10 нм (плазмонный пик 808 нм) и диаметром 25 нм (плазмонный пик 650 нм) концентрировали до 0,05 мл путем осаждения 3 мл каждого образца в микроцентрифуге Microfuge 16 от Beckman Coulter при 10 000 х g в течение 5 мин и последующего ресуспенидрования в воде с 0,01 М CTAB.

Градиент плотности готовили вручную в 15 мл центрифужных пробирках из полипропилена (кат. № 361707), как указано в таблице ниже:

Оба сконцентрированных образца AuNR обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин (с помощью ультразвукового диспергатора Branson MI800), а затем смешивали и наслаивали поверх градиента плотности.

Пробирки с градиентом и образцами центрифугировали 15 мин при 10 750 x g и 25°C в высокоскоростной центрифуге Avanti JXN-30 от Beckman Coulter с бакетным ротором JS‑24.15. Режимы ускорения и торможения были установлены на 3.

После центрифугирования материал поделили на фракции по 300 мкл. С помощью микропланшетного сканера Paradigm отбирали фракции с плазмонными пиками 808 нм и 650 нм.

Смену буфера осуществляли путем центрифугирования отобранных фракций на микроцентрифуге Microfuge 16 при 10 000 х g в течение 5 мин и ресуспендирования полученного осадка AuNR в 0,01 M CTAB. Для тщательной промывки осадка этот этап повторяли три раза, а по окончании ресуспендировали материал в 250 мкл 0,01 M CTAB.

Спектры поглощения образцов до смешивания, после смешивания и после разделения исследовали с помощью спектрофотометра DU 800.

Результаты и обсуждение

После анализа чистоты образцов методом абсорбционной спектроскопии (Рис. 1а) мы смешали их вместе и провели повторный анализ спектра поглощения (Рис. 1b).

Чистоту несмешанных образцов AuNR проверяли путем сравнения соотношения продольного плазмонного пика (800 нм и 650 нм для образцов AuNR 10 нм и AuNR 10 нм, соответственно) с поперечным плазмонным пиком (515 нм для обоих образцов).

Для чистых образцов AuNR 10 нм отношение коэффициентов поглощения при 650 нм и 515 нм составило 2,32. Для чистых образцов AuNR 25 нм такое отношение при 800 нм и 515 нм составило 3,85.

После фракционирования центрифугированной смеси и сбора оптически чистых образцов мы провели повторный анализ их спектра поглощения (Рис. 2). Соотношение пиков 650 нм/515 нм для очищенного образца AuNR 10 нм оказалось равным 1,91 и почти таким же высоким, как для чистого образца в начале эксперимента.

Для очищенного образца AuNR 25 нм соотношение пиков 800 нм/515 нм составило 4,54. Это значение даже выше, чем для чистого образца AuNR 25 нм в начале эксперимента. Это указывает на то, что исходный чистый образец AuNR 25 нм содержал примесь AuNS.

Рис. 1a. Спектры поглощения образцов AuNR 25 нм и AuNR 10 нм до их смешивания.		Рис. 1b. Спектр поглощения смеси образцов AuNR 25 нм и AuNR 10 нм.

Рис. 2. Спектры поглощения образцов AuNR 25 нм и AuNR 10 нм после разделения методом центрифугирования в градиенте плотности.		Рис. 3. Фотографии пробирки с материалом до (A) и после (B) разделения AuNR 25 нм и AuNR 10 нм центрифугированием в градиенте плотности.

Список литературы

1. Popovtzer R et al. Targeted gold nanoparticles enable molecular CT imaging of cancer. Nano Letters. 8.12; 4593–4596: (2008).
2. Huang X et al. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers in Medical Science. 23.3; 217–228: (2008).
3. O'Neal D P et al. Photo-thermal tumor ablation in mice using near infrared-absorbing nanoparticles. Cancer Letters. 209.2; 171–176 (2004).
4. 4. Hong G et al. Near-Infrared-Fluorescence-Enhanced Molecular Imaging of Live Cells on Gold Substrates. Angewandte Chemie International Edition. 50.20; 4644–4648: (2011).