Интервью с пользователем
Д-р Осаму Накагоми, проф. | Университет Нагасаки, Аспирантура биомедицины, Лаборатория молекулярной эпидемиологии

---

Использование коммерческих наборов для очистки и анализа геномов, а также для идентификации видов стало уже обычной практикой в области исследований вирусов. Поскольку геномы всех известных вирусов уже секвенированы, то видовая идентификация возможна даже при работе со смесью вирусов. Однако, чтобы провести детальное исследование природы вирусов, сначала необходимо очистить вирусные частицы в достаточно большом количестве.

В настоящее время наша компания получает много вопросов об использовании метода ультрацентрифугирования для очистки вирусов. В связи с этим мы попросили рассказать об основных принципах этого метода профессора Университета Нагасаки Д‑ра Осаму Накагоми, который является экспертом в данном вопросе.

---

— Пожалуйста, расскажите нам о проводимых вами исследованиях.

Рис. 1. Структура ротавирусных частиц и геномной РНК. Слева: интактная частица имеет трехслойную структуру, поэтому она называется трехслойной частицей (TLP); внешняя оболочка состоит из белков, которые на рисунке имеют красный и желтый цвет. Если она отслаивается, то остается двухслойная частица (DLP) с белками голубого цвета. Справа: характерная картина электрофоретического разделения геномной РНК ротавируса, состоящей из 11 сегментов. Схема строения ротавирусной частицы любезно предоставлена проф. Прасадом из Бэйлорского университета.

Мой научный интерес и профессиональные знания лежат в области молекулярной эпидемиологии ротавирусной инфекции.

Ротавирус A – один из самых серьезных вирусов, поскольку он является частой причиной смерти младенцев из-за острой обезвоживающей диареи во всем мире. До 1970-х годов причины инфантильной диареи были практически неизвестны. В 1973 году был открыт ротавирус, и наконец стало понятно, что именно он является этиологически агентом, ответственным за болезнь половины пациентов с диареей, поступающих в педиатрические отделения. Это было эпохальное открытие в медицинской вирусологии.

После преодоления многих препятствий в 2006 году были лицензированы разработанные ротавирусные вакцины. В 2009 году ВОЗ рекомендовала включать их в национальные программы иммунизации всех стран мира.

Расскажу вкратце об объекте моих исследований.

Ротавирус – это вирус, который не имеет оболочки. Его геном состоит из 11 сегментов двуцепочечной РНК (рис. 1). Подобно другим РНК-содержащим вирусам, он быстро развивается и характеризуется высокой геномной вариабельностью.

Этот вирус способен инфицировать не только людей, но и ряд млекопитающих и птиц. Впервые мы смогли установить, что ротавирусы животных могут быть патогенными для человека и быть причиной его заболевания, в 1980 году, использовав молекулярно- эпидемиологические методы, которые позволяют проводить исследования на геномном уровне.

Основной задачей нашей исследовательской работы является изучение развития ротавируса во время нахождения в организме хозяина (человека или других животных) и путей распространения инфекции. Также мы пытаемся проанализировать, какие изменения могут произойти при более масштабном использовании вакцин. По сути, в основе молекулярно-эпидемиологических исследований ротавирусов лежит анализ вирусного генома.

— Насколько целесообразно использовать ультрацентрифугирование при исследованиях вирусов?

При выделении генома из вирусных частиц классическими методами их необходимо вначале очистить. Геном, выделенный из таких частиц, затем анализируют. Ультрацентрифугирование играет важную роль в этом процессе. Очистка вирусных частиц позволяет с самого начала быть уверенными, что в них будет содержаться геном ротавирусов.

В настоящее время практически всегда такой анализ выполняется после быстрого выделения генома без предварительной очистки образца. Такой подход стал популярным после того, как геном ротавирусов оказался хорошо изучен. Ведь тогда стало понятно, что если выделенный геном имеет характерные черты ротавирусного генома (рис.1), то нет никаких сомнений, что геном ротавирусов присутствует в вирусных частицах.

Однако представьте себе ситуацию, что мы не знаем, какой тип клеточных органелл, вирусных белков и геномов содержится в инфицированной клетке. В таком случае ультрацентрифугирование становится незаменимым. Более того, при изучении новых вирусов определение содержания их генома в вирусных частицах является необходимостью. И в таких случаях очистка с помощью ультрацентрифуг становится неизбежной.

Ультрацентрифугирование проводят на основе информации о плавучей плотности, размере и коэффициенте седиментации (в единицах Сведберга, S) частиц. Все вместе эти характеристики являются физико-химическими свойствами вирусов и важными аспектами вирусологии.

— Расскажите об основах очистки вирусов с помощью ультрацентрифугирования.

Рис. 2. Плотность и коэффициенты седиментации вирусов и клеточных органелл.

При очистке ротавирусов, содержащихся в образцах, полученных от пациентов, мы должны отделить клеточные органеллы, биологические макромолекулы и другие подобные объекты от вируса. Это возможно благодаря тому, что все частицы отличаются по размерам и плотности.

При комбинировании центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, результаты которого зависят от величины S частиц, и равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия, результаты которого зависят от плавучей плотности частиц в растворителе, существуют диапазоны плотностей, в которых приходят в равновесие только интересующие вирусные частицы.

На рис. 2 показана зависимость плотности бэндирования (плотности, в области которой появляются полосы в ходе центрифугирования в градиенте плотности) от значения S. Вирусы локализуются в интервале между различными клеточными частицами, включая микросомы и рибосомы.

Вирусы представляют собой комплексы белков (плавучая плотность большинства из которых составляет 1,3 г/см³) и нуклеиновых кислот (1,7 г/см³), поэтому их плавучая плотность колеблется в диапазоне от 1,35 до 1,4 г/см³. При этом коэффициент седиментации вирусов достигает значений 100–1 000 S.

По горизонтальной оси коэффициенты седиментации микросомальных фракций перекрываются с коэффициентами седиментации вирусов, но по вертикальной оси происходит разделение по плотности. Таким образом очистку выполняют путем комбинации центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, хлорида цезия и т.п.

Вирусные фракции обладают большей плотностью, чем микросомальные фракции, поскольку содержат нуклеиновые кислоты. Кроме того, чем больше вирус, тем больше значение его коэффициента седиментации. Очистка методом ультрацентрифугирования опирается на эти два параметра, то есть она тесно связана с физико-химическими свойствами частиц.

С другой стороны, центрифугирование – один из главных методов определения этих физико-химических свойств. Надежную оценку размера частиц позволяет также дать электронная микроскопия, но в случае присутствия нового штамма вирусов, важно определить условия его равновесного состояния при центрифугировании.

Например, вирус гриппа и ротавирус имеют небольшой размер около 100 нм. Если центрифугировать их с помощью высокоскоростной охлаждаемой центрифуги Avanti при 10 000+ об/мин в течение ночи, то они осядут. В то же время норовирус размером 30 нм при этих условиях не осядет, и для него понадобится ультрацентрифуга Optima. Чтобы осадить частицы размером 30 нм с помощью центрифуги Avanti, очистку необходимо проводить, сократив объем после таких процедур, как высаливание.

Если располагать методы в зависимости от обрабатываемого объема в порядке от наибольшего к наименьшему, то в начале будет идти метод дифференциального центрифугирования (стандартное осаждение), затем – осаждение на жидкостную подушку и в конце – центрифугирование в градиенте плотности.

Если в случае осаждения на подушку пробирку можно заполнить образцом на 60–70%, то в случае центрифугирования в градиенте плотности объем сокращается до 10–15%. Поэтому после определения поведенческих характеристик частиц с помощью центрифугирования в градиенте плотности для охвата большего объема образца используют метод осаждения на подушку.

Например, ротавирусная частица проходит через слой 30% раствора сахарозы, но не проходит через слой 70% раствора сахарозы, поэтому вирус можно сконцентрировать на границе раздела слоев из 30% и 70% растворов сахарозы (рис. 3).

— Приведите конкретный пример очистки вируса методом ультрацентрифугирования.

Сравнение угловых и бакетных роторов

Традиционно угловой ротор по сравнению с бакетным позволяет обрабатывать больший объем образца и более прост в использовании при условии, что оба ротора позволяют достичь одной и той же центробежной силы. Однако, за счет того, что некоторые роторы, например, SW 32 Ti, можно загружать сверху, такое преимущество угловых роторов, как простота использования, можно не принимать во внимание. А поскольку пробирки бакетных роторов закрываются крышкой, то можно утверждать, что переносить руками их даже проще.

Если вам нужно аккуратно удалить бэнды, образовавшиеся в результате центрифугирования в градиенте плотности, то лучше использовать бакетные роторы. Осадок оставляет следы на стенках угловых роторов, и некоторые люди считают это проблематичным.

Например, в последнее время снизился порог чувствительности ПЦР в реальном времени, поэтому сейчас уже следует учитывать те загрязнения, которые раньше могли быть проигнорированы. В целом я думаю, что если вы работаете с большими объемами материала, то следует выбирать угловые роторы. Бакетные роторы имеет смысл использовать, если вы всерьез беспокоитесь из-за примесей.

Подготовка образцов к ультрацентрифугированию

Я расскажу об этапе подготовки образцов на примере очистки ротавирусов из культуральной жидкости инфицированных клеток (ICF – infectious culture fluid).

Поскольку выход очищенных частиц вируса примерно пропорционален исходному объему, рекомендуется использовать 1 литр ICF. После определенного концентрирования с помощью высокоскоростной охлаждаемой центрифуги образец продолжают концентрировать и очищать с помощью напольной ультрацентрифуги и бакетных роторов SW 32 Ti или SW 55 Ti.

На мой взгляд, SW 32 Ti – это ротор мечты, потому что благодаря продуманному дизайну его легко использовать. Мы используем этот ротор вместе с имеющейся в нашей лаборатории ультрацентрифугой Optima от Beckman Coulter Life Sciences. Я считаю Optima надежным партнером, в особенности каждый раз, когда я запускаю его на всю ночь. Я знаю, что всегда могу доверять ему и быть уверенным, что на следующий день получу ожидаемые результаты. Он еще никогда меня не разочаровывал.

На рис. 3 приведен наш протокол очистки ротавируса из ICF.

Прежде всего, чтобы избавиться от клеточного дебриса, мы разливаем 1 л ICF по 6 бутылям и центрифугируем в течение 10 мин при 15 000 g в угловом роторе JA-14. Этот шаг можно пропустить, но тогда на следующем этапе осаждения на подушку вы будете иметь дело с большим количеством примесей. Чем лучше вы выполните предварительную обработку, тем легче вам будет выполнять последующие операции и тем чище будет результат. Кроме того, в случае большого количества примесей вирус может в них застрять, что приведет к снижению выхода очищенного материала.

После удаления клеточного дебриса оставшийся супернатант снова центрифугируем в течение 14–16 часов при 30 000 g в угловом роторе JA-14, чтобы осадить вирусы. Если вы торопитесь, то вместо этого можно использовать ультрацентрифугу и центрифугировать по 300 мл супернатанта в угловом роторе Type 45 Ti либо в течение 2 ч при 30 000 об/мин, либо в течение 1,5 ч при 40 000 об/мин.

Затем ресуспендируем осадок в 26 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Для принятия решения, в каком объеме PBS имеет смысл ресуспендировать осадок, требуются опыт и интуиция. Как правило, на любой стадии очистки не следует концентрировать образец более, чем в 10 раз.

Например, если исходный объем материала составляет 1 л, вам не следует его сокращать более, чем до 100 мл. Если вы сократите его, скажем, до 10 мл, то получаемый продукт будет мутным. Для удобства работы вы можете захотеть сконцентрировать образец посильнее, но потом вы будете сожалеть об этом. Однако, это правило сугубо эмпирическое.

Рис. 3. Протокол очистки ротавирусных частиц.

Очистка вирусных частиц ультрацентрифугированием

Используя метод осаждения на подушку из раствора сахарозы и бакетный ротор SW 32 Ti, мы выполняем дальнейшую очистку суспензии вирусов от примесей.

Частицы ротавирусов можно сконцентрировать на границе слоев из 30% и 70% (м/о) растворов сахарозы. Для этого мы наливаем 4,5 мл 70% раствора сахарозы на дно ультрацентрифужной пробирки объемом 38,5 мл, а сверху наслаиваем 6,5 мл 30% раствора сахарозы. Поверх этого наливаем 26 мл суспензии вируса в PBS.

В ходе центрифугирования при условиях, перечисленных на рис. 3, огромное количество примесей собирается над 30% раствором сахарозы. Частицы ротавируса будут концентрироваться между 70% и 30% растворами сахарозы в виде белого бэнда. Материал этого бэнда можно отобрать тремя способами: непосредственно вводя шприц в бэнд, предварительно удалив слои жидкостей над бэндом или разделяя фракции путем введения иглы в основание пробирки.

Для дальнейшего увеличения степени чистоты можно выполнить центрифугирование в градиенте плотности хлорида цезия с помощью бакетного ротора SW 55 Ti. Для этого на дно ультрацентрифужной пробирки объемом 5 мл мы наливаем 55% (м/о) раствор хлорида цезия, а сверху наслаиваем такое же количество 40% (м/о) раствора хлорида цезия.

Наслоение растворов разной плотности является, как правило, трудоемкой процедурой. Однако градиент плотности может естественным образом сформироваться в ходе ультрацентрифугирования даже при первоначальном использовании всего двух слоев. Это небольшая уловка.

Грубую вирусную фракцию объемом 0,5–0,8 мл (в таких случаях всегда лучше использовать небольшие количества растворов), полученную методом осаждения на жидкостной подушке, наслаивают поверх растворов хлорида цезия, а получившийся материал ультрацентрифугируют в течение 16–20 ч при 257 000 g. Чтобы процесс длился шестнадцать часов, необходимо запустить его вечером предыдущего дня и остановить на следующее утро. При этом строгих требований к продолжительности не существует.

Как видно из рис. 3, в ходе ультрацентрифугирования в пробирке образуется два видимых бэнда, содержащих ротавирусы. Верхний бэнд с плавучей плотностью 1,36 г/см³ состоит из интактных трехслойных ротавирусных частиц (TLP), а нижний бэнд (1,38 г/см³) – из двухслойных ротавирусных частиц (DLP) без внешней оболочки.

Вирусные частицы содержат РНК. DLP-частицы состоят из меньшего числа белков, чем TLP-частицы, поэтому доля нуклеиновых кислот в них выше и они осаждаются сильнее. Самый верхний голубой бэнд содержит пустые частицы, состоящие только из белков и не содержащие нуклеиновые кислоты, поэтому их плавучая плотность составляет 1,3 г/см³.

Интересно, что при удалении с TLP-частиц внешней оболочки и образовании DLP-частиц активизируется РНК-полимераза. И в экспериментах с РНК-полимеразой используются именно DLP-ротавирусы с удаленной внешней оболочкой.

Очистка ротора после ультрацентрифугирования

Поскольку при центрифугировании используются растворы хлорида цезия высокой плотности, очень важно после работы промывать ротор теплой водой, чтобы предотвратить пористую коррозию.

Рис. 4. Сотрудники Лаборатории молекулярной эпидемиологии Университета Нагасаки.

Ссылки

1. Mazzone HM. CRC Handbook of Viruses: Mass-Molecular Weight Value and Related Properties. Boca Raton (FL): CRC Press LLC; 1998.