Выделение РНК из вирусов

Указания по применению

¹Qi Wei, Ph.D.; ¹Weiming Shen, MS, ASCP^CM; ¹Haixue Gan; ¹Dianelis Mondejar Alvarez; ¹Mendizabal; ¹Tania E. Pumariega; ²Cindy Heath; ²Han Wei, Ph.D.

¹Miami Cancer Institute, Miami, FL; ²Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN

Выделение РНК из вирусных образцов является важным этапом исследования патогенов. Здесь мы представляем подтвержденный протокол решения данной задачи.

Цели и задачи

Выделение вирусной нуклеиновой кислоты — это первый этап, необходимый для последующего геномного анализа методом ОТ-ПЦР.

Целью данной совместной работы института Miami Cancer Institute и компании Beckman Coulter Life Sciences было исследование аналитической эффективности набора реагентов RNAdvance Viral для выделения вирусной нуклеиновой кислоты из мазков, а также его сравнения с другими наборами, существующими на рынке.

Для этого с помощью данного набора выделяли РНК из вирусных образов в универсальной транспортной среде (следуя рекомендациям, данным в Инструкции по применению). Затем проводили количественную ОТ-ПЦР и сравнивали значения C_t.

Обзор рабочего процесса

RNAdvance Viral — это набор реагентов для выделения вирусной РНК по технологии обратимой твердофазной иммобилизации (технологии SPRI). Он позволяет получать РНК высокой степени очистки, при этом объем анализируемого образца может быть меньше 200 мкл.

Выделение РНК вручную из 24 образцов занимает около 1 часа. Выделениe РНК из 192 образов (два 96-луночных планшета) на роботизированной дозирующей станции Biomek i5 потребует около 1 часа 45 минут и минимального участия исследователя.

Процесс выделения РНК с использованием набора RNAdvance Viral (рис. ниже) состоит из этапов лизиса, связывания, промывки и элюирования.

Процесс выделения РНК из вирусных образцов

Представленные данные были получены Miami Cancer Institute.

Оценка аналитической эффективности: чувствительность

Контрольные образцы Exact Diagnostics SARS-CoV-2: 1) положительные (RUO, EDX, кат. №COV019) и 2) отрицательные (EDX, кат. №COV000), смешивали в отрицательной универсальной транспортной среде (HEALTHLINK, кат. № 330C.DHI) в концентрациях 200, 20, 2 и 0,2 копий/мкл. РНК выделяли вручную с использованием двух наборов реагентов: 1) RNAdvance Viral (Beckman Coulter) или 2) набора для выделения на основе магнитных частиц (конкурент A). Исследования методом ОТ-кПЦР проводили с помощью набора 2019-nCoV RUO компании Integrated DNA Technologies (IDT).

В исследовании использовали наборы праймеров, специфических по отношению к фрагментам N1, N2 и N3 нуклеокапсида SARS-CoV-2 (N1, N2 и N3), и набора парймеров для детекции РНКазы Р человека.

Чтобы обеспечить надлежащий контроль при тестировании, в исследование были включены контрольные образцы: 1) положительные 2019-nCoV_N_Positive Control (IDT: 10006625) и 2) отрицательные для кПЦР (NTC Ambion, кат.№ AM4932). Для контроля эффективности использовался стандарт Exact Diagnostics RNA Standard (стандарт SARS-CoV-2) без выделения РНК.

Полученные результаты показали сопоставимые значения C_t для реагентов RNAdvance Viral и набора для выделения «конкурент A» (Таблица 1). Для РНК, выделенной с помощью реагентов RNAdvance Viral, также были получены значения C_t, согласующиеся со значениями стандарта RNA Standard (стандарт SARS-CoV-2 без выделения).

Реагенты RNAdvance Viral показали эффективность выделения выше 95% и отсутствие ингибирования ПЦР. Эффективность выделения рассчитывали как отношение C_t набора RNAdvance Viral / C_t для стандарта RNA Standard для праймеров SARS-CoV-2 N1, SARS-CoV-2 N2 и SARS-CoV-2 N3 для всех титров вируса.

Аналитическая эффективность - это наименьшая концентрация копий вируса, при которой наблюдается амплификация ПЦР. В обоих случаях выделения были получены неопределенные значения Ct (при концентрации стандарта Exact Diagnostics RNA Standard 0,2 копии/мкл). Это свидетельствует о том, что аналитическая эффективность находится в диапазоне 0,2–2 копии/мкл.

Таблица 1. Оценка эффективности выделения.

Наименование образца	SARS-CoV-2 N1	SARS-CoV-2 N2	SARS-CoV-2 N3	RP
Конкурент A_200	28,550	28,572	27,923	26,353
Конкурент А_20	32,407	32,392	31,294	26,473
Конкурент А_2	35,852	35,978	35,713	26,615
Конкурент А_0,2	Не определено	Не определено	Не определено	26,646
RNAdvance Viral_200	28,775	28,633	27,891	26,346
RNAdvance Viral_20	31,971	32,082	31,252	26,382
RNAdvance Viral_2	35,126	35,680	35,979	26,409
RNAdvance Viral_0,2	40,324	Не определено	38,065	26,364
RNA Standard_200	27,676	28,147	27,201	27,976
RNA Standard_20	31,178	31,530	30,527	31,472
RNA Standard_2	35,491	34,925	35,033	35,102
RNA Standard_0,2	Не определено	37,801	36,253	37,458

Подтверждение аналитической эффективности

Чтобы подтвердить аналитическую эффективность (1 копия/мкл), полученную на этапе оценки, РНК выделили из стандарта Exact Diagnostics RNA Standard и внесли в отрицательную универсальную транспортную среду. Исходная концентрация стандарта RNA Standard — 1 и 2 копии/мкл. Образцы анализировали в четырех повторах для каждой исходной концентрации.

Значение C_t оценивали методом ОТ-кПЦР по протоколу из раздела «Постановка исследования» CDC 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR Diagnostic Panel instructions (CDC-006-00019). Для каждого образца исследовали гены N1, N2, N3 и RP. Кроме того, чтобы обеспечить надлежащий процесс тестирования, в протокол были включены положительные контрольные образцы 2019-nCoV_N_Positive Control (IDT: 10006625) и отрицательные контрольные образцы для кПЦР (NTC Ambion, кат. № AM4932).

При обеих концентрациях (1 и 2 копии/мкл) стандарта RNA Standard для реагентов RNAdvance Viral получены сопоставимые значения C_t (Таблица 2) и подтверждена аналитическая эффективность на уровне 1 копия/мкл.

Таблица 2. Подтверждение аналитической эффективности реагентов RNAdvance Viral.

Наименование образца	SARS-CoV-2 N1	SARS-CoV-2 N2	SARS-CoV-2 N3	RP
RNAdvance Viral_2-1	34,443	34,892	33,656	26,408
RNAdvance Viral_2-2	34,933	35,403	34,420	26,579
RNAdvance Viral_2-3	34,627	35,489	34,272	26,405
RNAdvance Viral_2-4	35,304	34,912	34,493	26,697
RNAdvance Viral_1-1	34,314	35,901	34,785	27,612
RNAdvance Viral_1-2	35,781	36,520	36,592	27,659
RNAdvance Viral_1-3	34,966	36,637	34,827	27,611
RNAdvance Viral_1-4	35,550	34,625	35,730	27,757

Соответствие образцов

Соответствие образцов было подтверждено путем сопоставления значений C_t с таковыми для ранее протестированных образцов, выделение РНК из которых осуществлялось с помощью набора «конкурент A». Были взяты 24 известных положительных образца со значениями C_t < 40 и 23 известных отрицательных образца SARS-CoV-2 (Таблица 3).

Все образцы отбирали с помощью палочек-тампонов (свабов) COPAN и хранили в универсальной транспортной среде HEALTHLINK. РНК из образцов выделяли вручную с помощью реагентов RNAdvance Viral. Исследование методом ОТ-ПЦР проводили с использованием наборов праймеров/зондов N2 и RP.

Чтобы обеспечить надлежащую процедуру тестирования в исследование были включены положительные контрольные образцы 2019-nCoV_N_Positive Control (IDT: 10006625) и отрицательные контрольные образцы для кПЦР (NTC Ambion, кат. № AM4932).

Результаты свидетельствуют о полном соответствии (100%) для всех положительных образцов. Однако 1 из 23 ранее отрицательных образцов оказался положительным, т. е. соответствие составило 96%. Оператор отметил, что в этом случае ошибка произошла при обработке образца.

Таблица 3. Значения C_t и сравнительная эффективность по отношению к известным положительным и отрицательным образцам SARS-CoV-2.

Тип образца	Кол-во образцов	Кол-во C_t < 40 / Общее кол-во	Кол-во соответствий / Общее кол-во
Известный положительный	24	24/24	24/24
Известный отрицательный	23	1/23	22/23

Выводы

Согласно представленным данным, эффективность выделения с помощью реагентов RNAdvance Viral превышает 95 %, и при этом ингибирование ОТ-кПЦР при последующем анализе отсутствует. Достигается аналитическая эффективность, равная 1 копии вирусной РНК на мкл.

Соответствие результатов обнаружения на известных положительных и отрицательных образцах составляет 100 % и 96 %, соответственно. Точность при сравнении со значениями C_t для РНК, выделенной с помощью набора конкурента, равна около 98 %.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что набор RNAdvance Viral - это надежное решение для выделения вирусной РНК в исследовательских целях из образцов мазков, помещенных в универсальную транспортную среду.

Наборы реагентов для выделения вирусной РНК от Beckman Coulter Life Sciences

RNAdvance Viral

Кол-во образцов: 768
Кат. №: C63510

RNAdvance Viral XP

Кол-во образцов: 1 056
Кат. №: C59543

Вебинар по теме

Посмотрите видеозапись вебинара о сотрудничестве компаний Beckman Coulter Life Sciences и Integrated DNA Technologies (IDT) для создания решений в области подготовки образцов для анализа методом ПЦР в реальном времени с использованием наборов реагентов для выделения вирусной РНК.

*Наборы RNAdvance Viral и RNAdvance Viral XP не являются медицинскими изделиями и не предназначены для диагностики in vitro. Только для научных исследований.