Качественный анализ аденоассоциированных вирусных векторов для генной терапии методом скоростной седиментации

By Dr. Elmar Spies, Beckman Coulter Life Sciences

Введение

С момента первых исследований в области генной терапии в начале 1980–х интерес к различным приложениям в этой области только нарастает. Согласно работе Ginn et al. (1) в 2018 году на этапах проведения или завершения находилось около 2 600 клинических исследований в области генной терапии. Наибольшее количество исследований имеет отношение к онкологическим заболеваниям, за ними следуют моногенные генетические заболевания и инфекционные заболевания (Таблица 1). В целом методы генной терапии можно разделить по способу доставки генетического материала на два типа: вирусные и невирусные. Невирусные методы, как правило, характеризуются непрямой и малоэффективной доставкой и только транзиентной экспрессией, но в то же время они отличаются большей упаковочной способностью и лучшей биобезопасностью по сравнению с использованием вирусных векторов (1). Однако главные преимущества вирусных систем лежат в области их высочайшего уровня доставки и самой природы вирусов (их способности заразить клетки хозяина и запустить механизм репликации). Среди всех известных вирусных векторов наиболее часто используются аденовирусы, затем ретровирусы и аденоассоциированные вирусные системы (AAV). Примечательно то, что именно AAV системы представляют наибольший интерес для исследователей в последние годы (1). Возможной причиной этого является их меньшая иммуногенность по сравнению с вирусными векторами других типов (2).

Клинические испытания вирусных векторов для генной терапии
Онкологические заболевания 65%
Моногенные генетические заболевания 11.1%
Инфекционные заболевания 7%
Сердечно-сосудистые заболевания 6.9%
Другие 10%
Таблица 1. Распределение завершенных, продолжающихся и одобренных клинических исследований в зависимости от заболевания в 2018 году, %

Аденоассоциированные вирусы

AAV - это непатогенные, безоболочечные парвовирусы размером около 22 нм, которые не могут реплицироваться без вируса–помощника (адено– или вируса простого герпеса) (2). Капсид вируса может содержать трансген размером 5 т.п.н. (включая последовательности ITR (инвертированных концевых повторов)) без снижения продуктивности вируса. Промотор, ген, представляющий интерес, и терминатор клонируются между обеими ITR последовательностями. После трансдукции трансген присутствует в виде эписомы в ядре, откуда происходит экспрессия гена, представляющего интерес. Эписомальная ДНК снижает риск интеграции, но может быть растворена после нескольких клеточных циклов (3). В качестве вирусных векторов для генной терапии используется несколько видов AAV. Данные серотипы проявляют специфический тканевой тропизм, что ограничивает их применение к определенным органам. В настоящее время проводятся исследования и работы по оптимизации состава капсида и снижению таким образом тропизма к определенным видам клеток (4, 5).

Пример 1: Контроль качества векторов rAAV с помощью метода аналитического центрифугирования (AUC)

Благодаря своей возрастающей популярности и расширения сферы применения метод AUC представляет большой интерес в качестве метода оценки качества rAAV векторов для клинического применения до вывода препарата на рынок.

Г–н Burnham с соавторами (6) показали, что с помощью экспериментов по скоростной седиментации можно охарактеризовать качество полученных вирусных векторов (а именно соотношение пустых капсидов и полных вирионов). Проведение всего одного эксперимента позволяет получить информацию об инкапсулированной ДНК, степени чистоты препарата, количестве агрегатов и количестве пустых и частично заполненных капсидов. Препараты AVV изучались при длине волны 260 нм и скорости вращения ротора 20 000 об/мин (6). На седиментограмме присутствовали: пик на 63S, соответствующий пустым капсидам; пик на 93S, соответствующий полным вирионам; пики расположенные между 63S и 93S, которые вероятно относились к частично полным капсидам; группа пиков с более высокими значениями коэффициентов седиментации, которые относились к агрегатам вирусных частиц. Кроме того, авторы оценили возможность метода AUC различать трансгены различных размеров. Было показано, что коэффициент седиментации трансгена, состоящего из 3 370 нуклеотидов, составляет 92S, тогда как трансгена из 4 200 нуклеотидов – 101S. Таким образом, метод AUC является перспективным методом для анализа векторов rAAV вне зависимости от их состава, длины трансгена или их серотипа.

Пример 2: Сравнение скоростной седиментации и других методов характеризации AVV векторов

В работе г–на Wang с соавторами изучалась возможность использования метода ионнообменный хроматографии (AEX) для детекции полных и пустых капсидов AVV, а также популяций с частично полными капсидами (7). Для этой задачи они использовали и другие методы, такие как: просвечивающая электронная микроскопия (TEM), ИФА в комбинации с количественной ПЦР. Авторами был подтверждено заключение о том, что AUC может быть использован в качестве общепринятого стандартного метода определения и характеризации AVV векторов. Результаты показали, что TEM не является в полной мере количественным методом, а предоставляет в большей степени качественную информацию о данном образце векторов AVV. ИФА/кПЦР не обладают достаточной точностью и разрешением. В заключении было проведено прямое сравнение методов AEX и AUC. Был сделан вывод от том, что с помощью AUC можно получить данные с более высоким разрешением по сравнению с AEX, о чем свидетельствуют полученные распредления пустых капсидов и полных вирионов. Экспериментальные данные, полученные с помощью AEX, показывают, что пик, соответсвующий пустым капсидам, частично накладывается на пик, который соответствует полным вирионам. В то же время на седиментограмме, полученной при анализе того же образца, эти пики полностью разделены. Кроме того, между ними можно различить еще один пик, который вероятно соответствует популяции капсидов с фрагментированным геномом. На графике, полученном с помощью AEX, данная популяция не наблюдается (Рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: Характеризация образца AVV векторов методами AEX и AUC (опубликовано с разрешения Wang и соавторов (7)). Сравнения хроматограммы AEX (A) и распредления коэффициентов седиментации, полученного с помощью AUC (B). E - пустые капсиды, F - полные вирионы, P – капсиды с фрагментированными геномами, X – неустановленная популяция. Процентное содержание, соответствующее пикам на графиках, представляют проценты площади при длине поглощения 260 нм без учета поправки на коэффициент чувствительности детектора.

Полученные результаты могут быть объяснены тем, что в отличие от метода AUC, в хроматографических методах используется матрица, через которую проникают частицы образца. Кроме взаимодействия образца с матрицей на результат могут также повлиять эффекты разбавления. Например, агрегаты AVV векторов могут быть частично растворены, что негативно повлияет на достоверность полученных экспериментальных данных. В то же время AUC является безматричный методом, при котором анализ поисходит в условиях, максимально приближенных к нативным.

О методе аналитического ультрацентрифугирования и центрифуге Optima AUC

  • Безматричный метод, который не требует использования стандартов.
  • Анализ проводится в нативных условиях при возможности варьировать состав буферного раствора в широком диапазоне.
  • С помощью одного эксперимента может быть получена информация о гетерогенности образца (количественное распределение популяций частиц в образце), молекулярных массах, агрегации, ассоциации и форме белковых молекул и др.
  • Оптические системы, используемые в аналитической ультрацентрифуге Optima AUC:
    • Оптика регистрации поглощения в области видимого и ультрафиолетового диапазонах
    • Интерференционная оптика Рэлея.
  • Объем образца:
    450 мкл и менее для стандартного двухсекторного центрального элемента.
    120 мкл и менее для равновесного шестиканального центрального элемента.
  • Диапазон длин волн: 190 – 800 нм.
  • Диапазон молекулярных масс:
    от 100 Да (например, пептиды, олигосахариды) до 100 000 кДа (например, вирусы, органеллы).
  • Диапазон концентраций:
    Для оптики поглощения: 0.005 – 2 мг/мл (лютеинизирующий гормон)
    Для интерференционной оптики: 0.025 – 5 мг/мл (БСА)

Список литературы

  1. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: An update. Ginn SL, Amaya AK, Alexander IE, Edelstein M & Abedi MR; (2018) Journal of Gene Medicine 20:e3015
  2. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. Naso MF, Tomkowicz B, Perry III WL & Strohl WR; (2017) BioDrugs 31:317-334/li>
  3. Gene therapy comes of age. Dunbar CE, High KA, Joung JK, Kohn DB, Ozawa K & Sadelain M; (2018) Science 359, Issue 6372, eaan4672/li>
  4. A brain microvascular endothelial cell-specific viral vector with the potential to treat neurovascular and neurological diseases. Körbelin J, Dogbevia G, Michelfelder S, Ridder DA, Hunger A, Wenzel J, Seismann H, Lampe M, Bannach J, Pasparakis M, Kleinschmidt JA, Schwaninger M & Trepel M; (2016) EMBO Molecular Medicine, (8)6/li>
  5. Pulmonary Targeting of Adeno-associated Viral Vectors by Next-generation Sequencing-guided Screening of Random Capsid Displayed Peptide Libraries. Körbelin J, Sieber T, Michelfelder S, Lunding L, Spies E, Hunger A, Alawi M, Rapti K, Indenbirken D, Müller OJ, Pasqualini R, Arap W, Kleinschmidt JA & Trepel M; (2016) Molecular Therapy, (24)6, 1050-1061/li>
  6. Analytical Ultracentrifugation as an Approach to Characterize Recombinant AAV Vectors. Burnham B, Nass S, Kong E, Mattingly M, Woodcock D, Song A, Wadsworth S, Cheng SH, Scaria A & O`Riodran CR; (2015) Human Gene Therapy Methods, 26(6), 228-42/li>
  7. Developing an Anion Exchange Chromatography Assay for Determining Empty and Full Capsid Contents in AAV6.2. Wang C, Mulagapati SHR, Chen Z, Du J, Zhao X, Chen L, Linke T, Gao C, Schmelzer AE & Liu D; (2019) Molecular Therapy Methods & Clinical Development, 15:257-63

 

Только для научных исследований. Не для клинической диагностики

  CENT-6498APP03.20RU 

Скачать PDF

Отправить

Helpful Links